傳說用耶穌在最后的晚餐中用到的圣杯喝水，便能長生不老。在一次掘金活動中，記載圣杯的碑石被發現，圣杯存在的可能吸引著大批的瘋狂的人展開尋找。印第安納瓊斯博士（Harrison Ford飾）也是他們中的一員，甚至連他的父親老瓊斯（Sean Connery飾）也陷入其中——但他給瓊斯留下圣杯的筆記后便不知所蹤。 踏上威尼斯的土地，瓊斯和事先約好的史奈達博士（Alison Doody飾）會面，他們在圖書館里憑線索找到圣盾后，卻開始遭到莫名的來自十字劍兄弟的追殺。 一番波折后，瓊斯終于找到了老瓊斯，同時，史奈達的納粹身份暴露，筆記被搶走。圣杯隨時都有可能落入納粹的手中。 于是，瓊斯父子倆開始聯袂上演拯救圣杯的精彩大戲！